Le processus de découverte de nouveaux médicaments représente un grand défi pour l’industrie pharmaceutique. Il se résume essentiellement à identifier de nouveaux composés (molécules naturelles ou synthétiques) qui vont idéalement évoluer en des médicaments agissant sur des cibles biologiques spécifiques responsable de disfonctionnements. L’identification des cibles thérapeutiques est liée à la connaissance du fonctionnement moléculaire, des voies métaboliques, des systèmes biologiques en général et à la cause des maladies.

L’achèvement du séquençage du génome humain a ouvert de grandes perspectives pour l’identification de nouvelle cible thérapeutique et le développement de nouveau médicaments. Avant l’ère de la génomique, tous les médicaments commercialisés ont été développé pour environs 500 cibles biologiques connues. Les scientifiques estiment à 3000 le nombre de nouvelles cibles thérapeutiques qui découleront du séquençage du génome humain.

Dans cette présentation nous allons explorer une des méthodes utilisée dans le processus de découverte de médicaments à savoir la modélisation moléculaire et le criblage virtuel. Ces méthodes d’application in silico touchent plusieurs domaines tels : la biologie, la chimie, la découverte d’agent thérapeutique, les polymères et même la nanotechnologie.

2. Criblage à haut débit

Le criblage à haut débit, en anglais High-Throughput Screening ou HTS est une méthode d’expérimentation scientifique, il représente une étape très importante dans le processus de découverte de médicaments et relève des domaines de la biologie et de la chimie. Il permet de tester un très grand nombre de composés chimiques (molécules naturelles ou synthétiques) avec des cibles pharmacologiques afin d’identifier des hits et cela en un temps très court.

Le criblage à haut débit met en œuvre des robots capables d’accélérer et d’automatiser des étapes de mise en contact de molécules potentiellement actives en pharmacologie (candidats médicaments) avec un système biologique qui reproduit certains aspects de la vie d’une organisme vivant ou de son dérèglement (maladie). Ce criblage est dit à haut débit car le processus est très rapide. La technologie du criblage à haut débit est issue des progrès de la biologie moléculaire, de l’informatique, de la robotique et de la miniaturisation. Depuis le début des années 90, il est devenu une technique clef de l’industrie pharmaceutique. Actuellement il existe peu d’outil statistique pour garantire la détection de hits avec un haut degré de confiance mais beaucoup de recherches sont entrain de faire afin d’introduire des méthodes statistiques robustes pour valider les hits et minimiser les faux positifs.

3. Criblage virtuel

Le criblage virtuel est une technique informatique utilisée en recherche dans le domaine de la conception des médicaments. Il consiste en un parcours test sur de larges librairies de molécules chimiques pour en sélectionner ceux qui ont plus de chance de se transformer en médicaments. Le criblage virtuel est le fruit des avancés scientifiques dans les domaines de la modélisation moléculaire, la chimie combinatoire et la biologie moléculaire. De nos jours typiquement un million de molécules doivent être testé en un courte période de temps, d’où la nécessité d’avoir des méthodes in silico pour faire un criblage rapide et efficace.

Pourquoi faire du criblage virtuel?

Premièrement pour des raisons sientifiques reliées à l’aaugmentation croissante du nombre de cibles, et notamment les cibles 3D, l’augmentation de la puissance de calcul des ordinateurs et une meilleure prédiction des interactions protéine-ligand.

Deuxièmement pour des raisons économiques reliées au coût très élevé du criblage à haut débit ou expérimentale qui n’est pas souvent possible dans le milieu de la recherche et dans les petites compagnies.

Le criblage virtuel se résume en une recherche dans une chimiothèque tridimensionnelle (3D) de molécules satisfaisant aux contraintes d’un pharmacophore et de la structure 3D d’une cible (protéine, ADN, ARN).

4. Sars

Le sars fait parti de la famille des coronavirus qui sont des virus d'ARN à brin positif. Ce virus est caractérisé par de forte fièvre, des malaises, des maux de têtes et de la toux. Il se transmet par le contact direct entre deux personnes (Anand et al, 2003). Le 31 décembre 2003, un total de 8096 cas ont été diagnostiqués dans 29 pays et le virus a fait 774 morts. Le Canada n'a pas été épargné avec 251 cas et 43 morts.

Tous les coronavirus codent pour des protéases similaires aux chymotrypsine qui sont nommées 3CL^pro. Ces enzymes capables de faire la protéolyse sont nécessaires à la maturation des virus (Matthews et al, 1999). Chez le sars la protéase principale s'appelle M^pro et elle resssemble à celle du picornavirus. Elle clive les polyprotéines pp1a et pp1ab à aux moins 11 sites qui ont comme séquence leucine-glutamine (L-Q) |site de clivage| suivit d'une sérine (S), alanine (A) ou glycine (G).

Étant donnée le rôle important de la M^pro dans le cyle du virus, cette enzyme est considéré comme une cible thérapeutique intéressante. En effet, en trouvant une molécule homologue à celle-ci, il serait possible d’inhiber la réplication du virus et ainsi réduire sa virulence.

5. Modélisation Moléculaire 3D

La modélisation moléculaire 3D permet de visualiser et de modifier les molécules dans un environnement virtuel. Plusieurs informations peuvent être observées sur ces molécules, telles que : les domaines de liaisons, les hélices alpha, les feuillets beta et tous les atomes qui les composent. Il est aussi possible d’obtenir des paramètres comme la charge de la molécule, son énergie minimale ainsi que les angles et les distances entre les atomes. De plus, les programmes les plus développés peuvent faire des calculs de mécanique classique, semi empirique et de mécanique quantique. Toutes ces données permettent de bien comprendre la molécule étudiée et ainsi, il est plus facile de trouver des molécules qui lui sont homologues.

Lorsque la structure 3D de la molécule est inconnue, il est possible de se basé sur d’autre molécule similaire. Dans le cas du sars, il existe des protéines de la même famille chez les autres coronavirus. Il suffit de modéliser la M^pro selon les observations faites sur ces enzymes 3CL^pro. C’est à ce niveau que l’information sur struture des molécules est utile (Anand et al, 2003).

à droite, il y a les domaines, les hélices alpha et les feuillets beta, tandis qu’a gauche il y a une superposition de plusieurs modèle de molécules

Une fois la modélisation terminé, il est possible de confirmer la structure 3D en superposant plusieurs molécules. Par la suite, il est possible de trouver la molécule inhibitrice qui va se lier au domaine actif ou au domaine de liaison de cette protéine. Par modélisation 3D, il est possible d’observer les liaisons et leurs forces pour trouver le meilleur inhibiteur.

Il existe d’autre méthode pour trouver des inhibiteurs, comme la superposition des ligands naturels. Dans ce cas ci, deux ligands le 1UK4-SARS (vert) et le 1P9U-TGEV (rouge) ont été obtenus à partir de coordonnée cristalline (voir figure page 6). À ce ligand est superposé d’autre ligands (6 au total) et cette molécule est ensuite lié virtuellement à l’enzyme pour vérifier la force des liaisons et le comporte des deux molécules ensemble.

Finalement, il est possible d’utilisé des inhibiteurs connus pour les protéines de même famille, puis de les modifier pour qu’ils soient efficace contre la M^pro. Il y a comme exemple, la molécule KZ7088 qui a été dérivé de la molécule AG7088 un inhibiteur de la protéase du rhinovirus (Sirois et al, 2004a).

à droite c’est une visualisation du ligand former de 2 peptides et à gauche c’est le ligand formé de 6 peptide lié à la protéase.

6. Identification de molécules médicamentables

Au cours du processus de découverte de médicaments, plusieurs librairies de petites molécules sont criblées afin de déterminer lesquelles ont le potentiel de donner des médicaments. Ces libraires de composés chimiques utilisés dans le criblage à haut débit (HTS) ou le criblage virtuel sont obtenues par plusieurs façons dont des composés obtenus par des efforts précédents d’optimisation de Lead ou dans d’autre cas simplement acheté à des compagnies spécialisées.

La majorité des molécules ne se qualifient pas jusqu'à fin du processus de découverte de médicaments. En fait plusieurs sont éjectés dans l'une ou l'autre des phases de ce processus. Ces échecs font augmenter les délais en moyenne de 10 années et des coûts associés sont de 500 à 800 millions de dollars US. Cette réalité a nuit énormément à l'industrie pharmaceutique et a diminué sa productivité jusqu'à 0.5 nouveaux médicaments par année.

Avec l’achèvement du séquençage du génome humain plusieurs nouvelles cibles thérapeutiques ont vu le jour. Par exemple il est estimé que le génome humain comporte 1000 récepteurs couplés à des protéines G pour approximativement 860 kinases. (Les protéines G de l'anglais guanine nucleotide binding proteins sont des molécules qui permettent le transfert d'informations à l'intérieur de la cellule.) Pour ces cibles potentielles seulement 10% des protéines ont été rationnellement caractérisées (Sirois et al, 2004b)

Afin de pallier à ces problèmes liés au grand taux d’échec dans les différentes phases du processus de découverte de médicaments, plusieurs stratégies sont utilisées pour réduire ce taux échec dont des stratégies de chimie combinatoire ou de la bioinformatique. Plusieurs techniques informatiques et algorithmes ont été introduit, tels que:

l la modélisation pharmacophore

l la modélisation 3D des protéines

l Docking Modeling

l la prédiction de site de restriction sur les séquences des protéines

l la prédiction des classes de familles d’enzymes

l et la prédiction des sites actifs.

De ce fait on s'est rendu compte de l'importance des propriétés physiques des molécules et de l'importance de ne sélectionner que ceux qui sont susceptibles de devenir des médicaments, d'où l'importance pour les compagnies pharmaceutiques et laboratoires de scruter à la loupe les différentes librairies de composés pour leurs propriétés physiques avant de passer au criblage à haut débit ou au criblage virtuel, et toutes les molécules peu probables de devenir des médicaments sont ainsi écartées du processus.

6.1 Filtrage de molécules

Afin d’implémenter ce processus de sélection de molécules, il faut d’abord savoir que-ce qui est un bon Lead et distinguer une molécule médicamentable d’une qui ne l’est pas. Plusieurs critères ont été établis afin d’éviter de faire des testes coûteux et inutiles. Ainsi il y a une convergence de règles qu’un Lead ou un médicament devrait satisfaire afin de les distinguer d’autres classes de molécules, de plus il y a un consensus que les molécules toxiques et réactives et ceux qui ne satisfont pas certains critères physico-chimiques et structuraux soient considérés comme non-médicamentables.

Une des méthodes utilisées pour filtrer les composés qui ont plus de chances de se transformer en médicaments de ceux qui n’en ont aucune, est l’utilisation des fonctions de scores sur les bases de données de molécules.

Sirois et Al 2004b, proposent, l’utilisation d’une fonction de score qui prend en compte les propriétés physico-chimiques et structurales des molécules disponibles dans les bases de données aussi bien que la présence de certains groupes fonctionnels indésirables. Cette méthode a été appliquée sur une liste exhaustive de base de données commerciales.

6.2 Fonction de score

La fonction de scores utilisée par Sirois et Al est exprimé en 12 métriques. Deux valeurs sont définies par l’utilisateur, un seuil minimum (cut-off) et un seul maximum. Cette méthode permet de rajouter ou d’exclure des molécules en ajustant manuellement les seuils.

Soit la fonction de score:

y_i représente le descripteur moléculaire à analyser, cut-off et maximum représentent les seuils minimum et maximum définis pour chaque descripteur comme dans le tableau suivant :

Ainsi la fonction de score pour les 12 métriques s’écrit :

Les facteurs individuels représentent :

- MPScore1 = reactive

- MPScore2 =MW> 500

- MPScore3 = Hacc > 10

- MPScore4 = Hdon > 5

- MPScore5 = logP > 5

- MPScore6=MW<100

- MPScore7 = Halogene > 7

- MPScore8 = CF3CF2CF2 > 1

- MPScore9 = BigRing > 7

- MPScore10 = RotBond > 10

- MPScore11 = (SSSR) cycles > 6

- MPScore12 = SingleChain > 7

La fonction de score normalisée pour une molécule s’écrit :

Le tableau suivant désigne les groupes fonctionnels non désirables dans les molécules à tester.

L’échelle de chaque MPScore dépend de la base de données de composés en question afin de permettre aux utilisateurs de faire des expériences en ajustant les valeurs de cuf-off et maximum suivant leurs besoins. Par exemple une base de données peut avoir 200 composés parmi 1000 qui ont un poids moléculaire supérieur à 500 Da, et 150 de des 200 composés qui ont un poids moléculaire inférieur à 525 Da. Une autre base de données peut avoir 200 molécules qui ont un poids moléculaire supérieur à 500 Da mais aussi supérieur à 600. Si on donne la même mesure au descripteur Poids Moléculaire les deux bases de données paraîtront comme si elles avaient le même score alors qu’elles ne le sont pas.

On mesure le score d’une base de données de molécules par l’équation suivante :

où Qscore_k représente le score normalisé du k_ième composé dans la base de données.

Le tableau suivant représente un exemple d’un ensemble de base de données aux quelles on a appliqué la fonction de score de 12 métriques.

7. Conclusion

Finalement, le criblage virtuel est un domaine en plein expansion qui va permettre de sauver du temps et de l’argent lors de la conception de médicaments. De plus, la construction de chimiothèque et de cibliothèque va faciliter le développement des thérapies futures. Ainsi, il sera possible de répondre plus rapidement à d’éventuelle épidémie puisque les molécules thérapeutiques seront déjà caractérisées.

Avec l’informatique, il est aussi possible de perfectionner les médicaments déjà existant à l’aide des programmes de modélisation moléculaire. Il suffit parfois de modifier quelques atomes pour diminuer les effets secondaires d’une thérapie. Ces mêmes programmes peuvent être utilisés pour adapter un médicament déjà existant à une autre maladie similaire.

Le cas du sars démontrent bien l’utilité d’appliquer le criblage virtuel et la modélisation pour accélérer la conception de thérapie et ainsi obtenir les médicaments plus rapidement.

8. Référence

¾ Anand, K., Ziebuhr, J., Wadhwani, P., Mester, J. et Hilgenfeld, R., 2003, Coronavirus main proteinase (3CL^pro) structure: basis for design of anti-sars drugs, Science 300

¾ Matthews, D.A., Dragovich, P.S., Webber, S.E., Fuhrman, S.A., Patick, A.K., Zalman, L.S., Hendrickson, T.F., Love, R.A., Prins, T.J., Marakovits, J.T., Zhou, R., Tikhe, J., Ford, C.E., Meador, J.W., Ferre, R.A., Brown, E.L., Binford, S.L., Brothers, M.A., DeLisle, D.M. et Worland, S.T., 1999, structure-assisted design of mechanism-based irreversible inhibitors of human rhinovirus 3C protease with potent antiviral activity against rhinovirus serotypes, proteolytic processing and physiological regulation, vol. 96, pp. 11000-11007

¾ Sirois, S., Wei, D.-Q., Du, Q., Chou, K.-C., 2004a, virtual screening for SARS-CoV protease based n KZ7088 phamacophore points, J. chem. inf. comput. sci., 44, pp.1111-1122

¾ Sirois, S., Hatzakis, G., Wei, D., Du, Q. et Chou, K.-C., 2004b, Assessment of chemical librairies for their druggability, computational biology and chemistry, 29, pp 55-67