Rapport de conférence de Henry Xing :

 

Quelques mesures pertinentes pour calculer la distance entre les communautés d'espèces dans des réseaux de similarité de séquence

 

Fait par : Gabrielle Boudreau et Stéphane Samson

Dans le cadre du cours : BIF7002

 

INTRODUCTION

La phylogénie est l’étude des relations d’évolution entre les organismes.1 Ce domaine repose sur l’hypothèse que tous les êtres vivants descendent d’un ancêtre commun.1 À partir de cet ancêtre commun, des évènements de spéciation tels l’isolation d’une population ou l’adaptation à un nouvel environnement peuvent entrainer ses descendants vers des branches évolutives divergentes.2 La phylogénie tente de reconstruire l’histoire de ces spéciations successives durant l’évolution en reconstituant les filiations évolutives à partir de données génétiques.1 En assumant que le taux de mutation génétique reste constant tout au long de l’histoire biologique, le nombre de mutations identifiées entre deux individus, populations ou espèces peut servir d’horloge évolutive et aider à déterminer quand la séparation s’est produite.1 Depuis l’origine des espèces de Darwin, les arbres phylogénétiques ont été largement utilisés comme représentation schématique de l'évolution.1

 

Arbre phylogénétique

Ce graphe connexe acyclique d’ensemble de nœuds est connecté par des arêtes de telle sorte que toute paire de nœuds sont reliée par exactement un chemin (Figure 1).3 Les êtres les plus proches ne divergent que dans les dernières branches de l’arbre, tandis qu’une ancestralité commune éloignée est marquée par un positionnement sur des branches très divergentes. À partir de ces arbres, il est possible de calculer différentes mesures de distance évolutive, tels que la distance de Robinson et Foulds, des quartets, ou encore la distance UniFrac. Cependant, une multitude d’études ont démontré que les arbres phylogénétiques ne permettent pas de bien représenter le transfert génétique latérales.1,4,5 De plus, une autre des limites de ces modèles évolutifs simplifiés est leur capacité de représenter l'hybridation et l'introgression entre les espèces et la recombinaison de diverses formes.6-8 Ces limites reconnues des arbres phylogénétique ont motivé l’adoption de représentation graphique alternative, les réseaux.3,9

 

https://lh5.googleusercontent.com/3EH7KN6o_1-zm-aIuAri3WR19xNy8is8taUGDPy_viO5n8vRTGNNSUCvEZGvZOoQLIwKybYoFoVUIWOcKklM--xRcYapczH2q9TP_1p8fldBMkp-YiBwDt57CqCCjDsM2_fynUNr

Figure 1 : Représentation d’un arbre phylogénétique. Cet exemple tiré de Mondal et al. représente l’arbre phylogénétique des différentes souches d’influenza H1N1 et H1N2, basée sur la protéine hémagglutinine virale (HA). 

   

Réseau phylogénétique

Les réseaux phylogénétiques sont adaptés pour représenter les phénomènes évolutifs complexes et ont permit l’émergence de nouveaux calculs de distance évolutive.10-13 Ceux-ci sont une méthode de modélisation des relations entre diverses composantes représenter respectivement par des arêtes et des nœuds (Figure2).14 Dans un contexte phylogénétique, les composantes, soient une séquence, un gène ou un génome d’un organisme, sont généralement représenté par un nœud tandis que les arêtes démontrent une similarité entre les séquences supérieure à un seuil donné. La similarité est une valeur qui se mesure en pourcentage d'identité, l’identité elle même définie comme le niveau de ressemblance entre deux séquences. 

 

 

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Figure 2 : Schématisation des éléments d'un réseau où A et B représente un nœud et C représente une arrête.

 

Distances évolutives

Henry Xing et ses collaborateurs ont développé cinq nouveau calculs de distance évolutive pouvant être calculés à partir de réseaux phylogénétiques : NetUniFrac, Spp, Spep, Spelp et Spinp. La distance NetUniFrac est la généralisation pour les réseaux de UniFrac, une distance évolutive calculé sur les arbres phylogénétiques.

 

UniFrac qualitative est une méthode phylogénétique mesurant la distance entre les communauté biologique (Formule 1).15 Cette méthode est une fraction de la longueur des branches dans un arbre phylogénétique qui mène aux descendants d’un échantillon ou l’autre, mais pas les deux. Elle permet de déterminer si les communautés biologiques sont significativement différentes, identifier les lignées individuelles qui contribuent à ces différences et révéler des schémas généraux reliant de nombreux échantillons.15 

Formule 1 : Formule de distance d’évolution UniFrac qualitative où Uab est la distance UniFrac entre l’échantillon A et B, unique est la somme de la longueur des branches qui mène à des espèces d’une seule communauté et total est la somme de la longueur de toutes les branches.

NetUniFrac, tant qu’à elle repose sur les arêtes monochromes (Formule 2). Une arête est dite monochromes si à ses deux extrémités, les espèces associées appartiennent à la même communauté. Ce calcul a pour avantage d’être calculée dans un temps linéaire par rapport au nombre d’arêtes du réseau. 

Formule 2 : Formule de distance d’évolution NetUniFracssnUab est la distance NetUniFrac, monochrome est la longueur totale des arêtes monochromes du réseau et total est la longueur totale des arêtes du réseau.

 

Les quatre calculs de distance, Spp, Spep, Spelp et Spinp, sont basé sur le chemin le plus court. Ce paramètre de centralité des nœuds indique la place de ce nœud par rapport aux autres nœuds du graphe. Dans un réseau hautement centralisé, il y a convergence vers une composante centrale qui mène à plusieurs spéciations. Un réseau moins centralisé, quant à lui ne possède pas de point central. Le chemin le plus court entre deux nœuds a et b correspond à la séquence de nœuds connectés par des arrêtes tel que le nombre de nœuds intermédiaires est minimal dont les extrémités du chemin sont les nœuds a et b. Le chemin le plus court est donc définies par le diamètre du réseau.16  

 

La distance Spp Shortest path proportion») est la proportion des chemins les plus court qui sont monochrome par rapport  à l’ensemble des chemins du réseau. (Formule 3)

 

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Formule 3 : Formule de distance d’évolution SppSpp est la distance évolutive Spp, x et y sont deux communauté d’espèce, K(i,j) est le nombre de chemins entre les nœuds i et j, NX et NY sont  le nombre de nœuds dans les communautés X et Y. Si le chemin K entre les nœuds i et j est monochrome  est de 1 sinon 0.                       

 

La distance Spep Shortest path edge proportion») est basé sur le nombre d’arêtes monochromes dans tous les chemins les plus courts entre les espèces d’une même communauté (Formule 4).

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Formule 4: Formule de distance d’évolution SpepSpep est la distance d’évolution Spep, x et y sont deux communauté d’espèce, K(i,j) est le nombre de chemins entre les nœuds i et j, NX et NY sont  le nombre de nœuds dans les communautés X et Y.  est la proportion d’arêtes monochromes dans le chemin k entre ij les nœuds i et j appartenant à la même communauté.

La distance Spelp Shortest path edge length proportion») est basé sur la longueurs des arêtes dans tous les chemins les plus courts monochromes (Formule 5).

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Formule 5: Formule de distance d’évolution SpelpSpelp est la distance d’évolution Spelp, x et y sont deux communauté d’espèce, K(i,j) est le nombre de chemins entre les nœuds i et j, NX et NY sont  le nombre de nœuds dans les communautés X et Y.  est la proportion des longueurs d’arêtes monochromes dans le chemin k entre les nœuds i et j appartenant à la même communauté.

     

La distance Spinp Shortest path internal node proportion») est la proportion des noeuds internes d’un chemin le plus court appartenant à la même communauté d’espèces à ces deux extrémités (Formule 6). Si le chemin le plus courts ne contient pas de noeuds internes, la longueur est donc de deux, la valeur 1 est ajouté au numérateur et au dénominateur. 

 

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Formule 6: Formule de distance d’évolution SpinpSpinp est la distance d’évolution Spinp, x et y sont deux communauté d’espèce, K(i,j) est le nombre de chemins entre les nœuds i et j, NX et NY sont  le nombre de nœuds dans les communautés X et Y.  est la proportion des nœuds internes de la même communauté dans le chemin k entre i et j qui appartiennent à la même communauté d'espèces.

                   

Virus de la grippe de type A

Les virus de la grippe de type A ont une génétique très diversifié du à deux phénomène: la dérive antigénique et le réassortiment.17 La dérive antigénique découle de l’ARN polymérase des virus de la grippe qui ont une faible fidélité induisant ainsi un haut taux d’erreur de réplication.17 Le réassortiment survient lorsqu’une cellule infectée par deux virus de la grippe différents et que ces virus s’échangent des segments de gènes lors de leurs réplications.18  Les nouveaux virus ainsi formés possèdent des caractéristiques hydrides des virus parentaux. Ces deux phénomènes ont mené à l'émergence de nouvelle souches de virus de la grippe porcine AH1N1 qui a causé la première pandémie de grippe du 21e siècle.

 

Le mode de transmission du virus de la grippe A requiert l’activité protéique de ses deux glycoprotéines de surface, l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA).19 La HA permet la fusion de la membrane virale à la membrane intracellulaire endosomale en se liant aux récepteur de l’acide sialique. La NA clive ces récepteurs afin de réduire l’affinité de d’autres virus envers la même cellule hôte.19 Dû à sa fonction essentielle dans l’efficacité de virulence et sa position en surface du virus, la glycoprotéine HA est au cœur de la stratégie immunitaire de l’hôte.19 Ainsi, un taux de mutation élevé de la structure protéique est nécessaire afin d’échapper au système immunitaire de l’hôte.

 

En se basant sur ces connaissances, nous avons voulu comparer l’évolution et la diversification des séquences HA des virus AH1N1 infectant l’humain et les porc. Pour ce faire, nous avons d’abord récupérer les séquences des HA des virus AH1N1 provenant soit de l’humain ou du porc. À partir de l'alignement multiples de ces séquences, nous avons créer un arbre phylogénétique et un réseau de similarité sur lequel nous avons mesuré les cinq distances évolutives développé par le groupe du Dr Makarenkov.

 

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Élaboration du jeu de données

Cinq séquences humaines (Numéro d'accession : ACQ89903, ACY78004, ACY77904, AFY24010, ACY77944) et sept porcines (Numéro d'accession NCBI : AKJ82484, ADG58953, ADU02154, ACY82404, ADA63254, ADG01948, ADU02153) de la protéine HA prélevées et séquencées lors de la pandémie de AH1N1 non-identique ont été sélectionnées aléatoirement sur la base de données du virus de l’influenza des serveurs du NCBI.20 Toutes les séquences humaines et porcine proviennent respectivement du Mexique et de l’Asie ainsi que l’Europe. 

 

Réseau phylogénétique

Un alignement multiple des séquences a été effectué avec l’outils MUSCLE.21 À l’aide du programme OmicsBox (OmicsBox, 2019) une base de données local de BLAST contenant uniquement les 12 séquences a été créer. Les pourcentages de similarité ont été obtenus par un BLASTp entre les séquences contre la base de donnés locale. À partir de ces pourcentages de similarité, un réseau igraph dans R a été produit. 

 

 

Arbre phylogénétique

À partir de l’alignement multiples de MUSCLE, un arbre phylogénétique a été construit et visualisé avec l’outil phyML dont le modèle utilisé est Flu + G.21,22 

 

Distances évolutives       

La distance UniFrac a été calculés selon la Formule 1. Les distances évolutives ont été calculés selon la documentation de l’application R NetFrac.

               

RÉSULTATS

L’arbre phylogénétique HA de la Figure 3 contient 12 séquences de la protéine HA de 566 acide aminées. Nous avons utilisé le modèle de substitution d’acide aminé FLU, puisque celui-ci a été conçu pour estimer la distance des séquences provenant de la grippe. Le taux de variation G considère l’hétérogénéité du taux de substitution entre les sites selon une distribution gamma. Nous avons utiliser la distance NNI «Nearest Neighbor Interchange » et la distance SPR «Subtree pruning and regrafting» dans le but d’obtenir le meilleur embranchement possible. Avec l’une ou l’autre des méthodes les arbres résultants sont ressemblant et toutes les branches ont une longueur de zéro. De ce fait, la distance évolutive UniFrac est elle-même de zéro.

https://lh6.googleusercontent.com/j9kSni9GXYUdNSzW8cua_L4aQYDX1TLSTkWypLSytVS_u7A1QXt4DKP2SyKBRPmuv1n9kqa-Gv4fV-2aR5e0ctshJKMO9A32M9_8KOlA7IH4xlbPooSEaz9LTjxZ_JnUpTAc4v-L

Figure 3 : Arbres phylogénétique HA du virus de la grippe porcine AH1N1 obtenue A avec la distance NNI et B avec la distance SPR. Toutes les séquences humaines proviennent du Mexique. Les séquences porc001, porc003, porc004, porc005, porc006, porc007 proviennent respectivement du Royaume-Unis, Corée du Sud, Singapour, Taiwan et de la Thaïlande. Les séquences porc002 et porc003 de la Chine. 

Le réseau de la Figure 4 exprime les relations de similarités des séquences protéiques et est composé de 12 nœuds et 20 arêtes. Chaque séquence protéique étudiée représente un nœud du réseau et chaque arête correspond à un taux de similarité d’au moins 99.7% entre deux séquences. Chaque arête est accompagnée d’un poids relatif à la proximité des deux séquences et d’un multiplicateur de 1,5 fois si les deux séquences appartiennent à la même espèce, afin de simuler la facilité relative de transmission. On peut observer deux séquences centrales au réseau (Porc7 et Humain2) qui ont chacun neuf arêtes. Seule le nœud Humain5 ne possède aucune arête monochrome, celle-ci n’étant relié qu’à une seule séquence porcine. Également, le nœud Porc2 est la seule séquence qui est uniquement reliée par une arête monochrome.

 

https://lh6.googleusercontent.com/N1-nxWtifV-VTR4whUYgFUxkX0g14QztC_6h4Hejc1FkT-8o0jCKMKX3HUUjXlCiFgZYyn4Lho84f-_Z-m6OYgIy_IdAGhVgoYLrxOvEDd68b_Qj0RAUSXs4yOZoLKvMXYvyiU9g

Figure 4 :  Réseau phylogénétique de similarité de séquences protéiques d’hémagglutinine provenant de la grippe AH1N1 humaine et porcine. Les arêtes représentent un pourcentage de similarité entre deux séquences est supérieur à 99,7%. Les séquences humaines et porcines sont représentées respectivement par les nœuds jaunes et roses. Les séquences porc001, porc003, porc004, porc005, porc006, porc007 proviennent respectivement du Royaume-Unis, Corée du Sud, Singapour, Taiwan et de la Thaïlande. Les séquences porc002 et porc003 de la Chine.

 

Les résultats des mesures de distances, tels que représentés dans le tableau I, ont été obtenus à partir de l’application R NetFrac, lorsqu’appliqué sur le réseau phylogénétique des séquences de la grippe AH1N1. On peut y observer des valeurs relativement faibles de distances Spp «shortest path proportion», Spep «shortest path edge proportion», Spelp «shortest path edge length proportion» ainsi que la distance de transfert. La distance NetUniFrac de 0,51 indique un partage presque uniforme des séquences entre les deux souches. Le résultat de la distance Spinp «shortest path internal node proportion» est nettement plus élevé que les autres distances, avec un valeur de 0,79.

 

Tableau I : Résultats des mesures de distances évolutives offertes par le programme NetFrac, lorsqu’appliqué au réseau phylogénétique de la Figure 4.

 

Distance

Résultat

NetUniFrac

0.51

Spp

0.32

Spep

0.39

Spelp

0.41

Spinp

0.79

Transfert

humain - porc

0.30

Transfert inverse

porc - humain

0.33

 

DISCUSSION

Les processus de virulence de la grippe A et les réponses immunitaires de l’hôte sont à la source du haut taux de mutations observées dans le génome viral du AH1N1. Parfois, des sauts d’espèces hôtes peuvent se produire suite à ces évènements de mutations, comme les événements de la pandémie de 2009 le démontre. La protéine HA se trouve au cœur de ces mutations et du processus de virulence dû à son rôle dans l’internalisation du virion et le ciblage qu’en fait le système immunitaire. Ainsi, l’évolution entre les HA provenant de l’humain et du porc a été le sujet d’étude. Pour ce faire, un jeu de donnée contenant 12 séquences HA dont cinq provient de l’humain et sept provient du porc a été créé. À partir de l’alignement de ces séquences, un arbre ainsi qu’un réseau phylogénétique ont été construit.

 

La distance UniFrac calculée pour l’arbre phylogénétique de la Figure 3 a une valeur de zéro. Ceci découle du fait que toutes les branches de l’arbre HA avait une longueur de zéro. La longueur des branches d’un arbre est proportionnelle à la distance évolutive entre les deux séquences. Le tout indique que toutes les séquences sont identiques. Or, l’alignement multiples des séquences prouve que celle-ci ne sont pas identiques à 100%. La résolution de phyML de 10-2 est trop faible afin de détecter le peu de mutations entre les séquences étudiées.23 À partir de l’alignement multiples des séquences (Figure supp 1 et 2), il est possible de calculer (1 mutation / 566 a.a) que la résolution minimale est de 10-3, puisqu’il y a au minimum il y a une mutation pour 566 site.  

 

La distance NetUniFrac, qui est une généralisation de la distance UniFrac pour les réseaux, est basée sur la proportion du nombre d’arêtes monochrome du réseau par rapport au nombre total d’arêtes. La valeur de 0,51 obtenue signifie que la moitié des arêtes sont monochromes. Cela concorde avec l’observation visuelle du réseau. Les deux séquences centrales (Humain2 et Porc7) sont reliées à la grande majorité des autres séquences, la moitié étant monochrome.

 

Les mesures Spp, Spep et Spelp calculés sur le réseau sont toutes sensibles au plus court chemin monochrome entre deux points. Cependant, la présence des deux nœuds centraux connectant la grande majorité des autres séquences affecte l’application de ces mesures, qui sont respectivement 0,32, 0,39 et 0,41. Ces valeurs sont rapprochées et démontrent que dans ce type de réseau, les variations du calcul du plus court chemin (le nombre d’arêtes dans le cas de Spep et leur poids dans le cas de Spelp) n’ont pas une incidence marquée sur la valeur finale obtenue. Ainsi, ces variations du calcul de mesure suggèrent que les séquences humaines et porcines sont relativement similaires. Cela concorde avec la théorie, considérant que le seuil de sélection des séquences était de 99,7% de similarité.

 

Cependant, la valeur Spinp, qui prend en compte les nœuds internes monochrome ainsi que la pertinence statistique des espèces associées aux nœuds a produit une valeur de 0,79, ce qui est fortement supérieur aux autres variations de la mesure du plus court chemin et suggère que les séquences humaines et porcines sont relativement moins similaires.  

 

De plus, les résultats de transfert et transfert inverse, qui représentent la proportion des chemins les plus courts étant monochrome, ont été déterminé comme étant similaire entre l’humain et le porc (0,30 et 0,33). Cette valeur signifie en théorie que beaucoup de gènes ont été transmis d’une espèce vers l’autre et vis-versa. Il est probable que le haut taux de mutation de la protéine HA mène à des représentations similaires chez l’humain et le porc de façon indépendante. Dans ce cas-ci, les valeurs de transfert auraient donc un pouvoir de prédiction limité.

CONCLUSION

En conclusion, des séquences virales de AH1N1 porcines et humaines très similaires ont été utilisées pour produire un arbre et un réseau phylogénétique. Il n’a pas été possible de détecter de différence évolutive à partir de l’arbre phylogénétique. Le réseau a permis obtenir divers mesure de distances évolutive entre les communautés à l’aide du programme NetFrac. Tel qu’attendu, les trois mesures Spp, Spep et Spelp obtenues indique que nos échantillons étaient similaires. Cependant, la mesure Spinp, basée sur le calcul des nœuds interne des plus courts chemins a produit une valeur beaucoup plus forte, qui suggère une similarité plus faible entre les communautés. Le tout tant à démontrer que les réseaux phylogénétiques et les nouveaux calculs de distance développée par l’équipe du Dr Makarenkov sont plus adaptés afin de représenter les phénomènes évolutifs complexes, tel que le réassortiment.

 

Il serait intéressant de tester l’application NetFrac avec des réseaux viraux de taille plus grande afin de produire des résultats avec plus de poids statistique et moins de biais de sélection. De plus, les mesures de plus court chemins pourraient être testés avec des réseaux reflétant divers degrés de séparation entre les communautés afin de voir le comportement de chaque variation de la mesure Spp.

 

RÉFÉRENCES       

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ANNEXE

 

 

 

 

Figure Supp 1 : Alignement multiple des position 1 à 300 des séquences HA du virus AH1N1.

Figure Supp 2 : Alignement multiple des position 301 à 566 des séquences HA du virus AH1N1.