De la biologie intégrative à l’identification de nouvelles cibles thérapeutique

En effet, cette expression peut être entendue dans différents sens, et notamment dans le sens de biologie systémique. Or, ce n’est pas l’acception que nous utiliserons ici, c’est pourquoi nous ajouterons le qualificatif « computationnelle » pour marquer la différence.

La biologie intégrative computationnelle est l’intégration d’une masse importante de données hétérogènes, moléculaires (génomique, transcriptomique, protéomique, métabolomique) ou autres via des outils informatiques et mathématiques. Les données à intégrer peuvent concerner différentes espèces.

La finalité principale de l’utilisation de la biologie intégrative computationnelle est de pouvoir exploiter de la façon la plus efficace possible l’ensemble des données biologiques possibles.

Nous allons dans cette étude nous intéresser à l’intérêt et aux limites de la biologie intégrative computationnelle et à ses applications dans le domaine de la recherche fondamentale, mais aussi à ses applications dans l’industrie.

II Les types de données

a/ Les données d’expression

Ces données correspondent à ce qu’on appelle le transcriptome. Le transcriptome est l'ensemble des ARNm issus de l'expression d'une partie du génome d'un tissu cellulaire ou d'un type de cellule.

Ce type de données est généralement obtenu de 2 manières :

- des expériences in vivo comme par exemple l’hybridation in situ, qui offrent une bonne résolution spatiale et temporelle, mais qui ont pour inconvénient le bruit inhérent à l’expérience.

- Les puces à ADN, qui souffrent du manque de standardisation entre les différentes plateformes, notamment au niveau de la présentation des résultats.

b/ Interactome

L’interactome est l’ensemble des données sur les interactions physiques entre les molécules biologiques d’une cellule, il peut s’agir d’interactions protéine-protéine mais aussi d’interactions entre gènes.

Une des principales techniques utilisées est Y2H (Yeast two-hybrid assay) ou double-hybride. Des expériences Y2H ont été menées sur l’intégralité des génomes de l’homme, du ver et de la mouche. Donc, on dispose d’une quantité importante d’informations sur les interactions protéine-protéine. En comparaison, peu de données sont disponibles sur les interactions génétiques.

La technique Y2H présente un haut taux de faux positifs : en effet, il peut exister des interactions entre des protéines, alors qu’in vivo elles ne sont jamais synthétisées au même endroit ou au même moment. Il est donc nécessaire de recouper les résultats obtenus.

c/ Données de régulation de la transcription.

Les données sont principalement obtenues par la méthode ChIP (chromatin ImmunoPrecipitation) qui détecte les interactions protéine-ADN in vivo. Cette technique a ses faiblesses puisqu’une protéine peut se lier à une séquence d’ADN sans qu’il y ait de conséquence, on observe du coup un certain taux de faux positifs.

d/ Les données phénotypiques

Les données phénotypiques d’un gène portent sur les conséquences produites par l’altération de ce gène. Ces données sont ajourd’hui essentiellement obtenues par :

- ARN interférent

- Knock Out ciblé

e/ Ontologies et annotations fonctionnelles

Dans le sens général, l’ontologie est l'ensemble structuré des termes et concepts fondant le sens d'un champ d'informations, et son objectif premier est de modéliser l’ensemble des connaissances dans un modèle donné.

Donc, le but est ici de limiter la confusion des voix autour de l’annotation de l’information moléculaire sur les gèns et leur produit.

Par exemple, une gène ayant l’annotation « létalité embryonique » ne serait pas, sans l’utilisation d’une ontologie phénotypique, associé fonctionnellement à un gène annoté « défaut de gastrulation », alors que le défaut de gastrulation mène à une létalité embryonnaire. C’est cette perte d’information que l’ontologie est censé éviter.

Le GO (Gene Ontology) Consortium (2006) fournit une des plateformes d’annotations fonctionnelles de gènes les plus utilisées. Ce travail a donné naissance à trois ontologies respectivement consacrées aux fonctions moléculaires, aux processus biologiques et aux composants cellulaires. Il est à noter que Gene Ontology est de plus en plus utilisé par la communauté des biologistes. Ceci s’explique notamment par le fait que les données de Go sont contrôlées à la main.

De par sa qualité, GO est non seulement utilisé comme un ensemble de données potentiellement intégrables, mais aussi comme un moyen de contrôler les performances de méthodes d’intégration de données. Sa seule limite est le manque d’informations : en effet, de nombreux gènes ne sont associés à aucune annotation, Chez C.elegans, 80% des gènes ne sont pas annotés. Une solution possible pour remédier à ce manque d’informations, est de croiser les données de plusieurs espèces, donc en prenant compte des gènes orthologues.

Exemples de bio-ontologies (source GO)

f/ Conclusion

L’utilisation combinée de l’ensemble de ces données a pour but de limiter le champ d’investigation, mais pour cela les données utilisées doivent être fiables et donc de très bonne qualité.

Une autre limite est le manque d’informations, en effet l’intégration de données ne remplace pas le travail du biologiste dans le screening du génome, mais le valorise; le biologiste doit donc continuer à produire des données. Et son rôle est aussi important dans la validation des conclusions tirées de l’intégration de données.

III Comment intégrer les données biologiques

L’intégration se fait par des traitements statistiques à travers des outils informatiques. Donc, une des premières tâches est de traduire ces informations dans un langage compris par l’ordinateur, une manière de le faire est de par exemple convertir en code binaire la présence ou l’absence d’une annotation pour chacun des gènes d’un génome. Mais, il faut aussi être vigilant à ne pas perdre de l’information au moment de l’encodage des données dans un format compréhensible par un ordinateur, donc quand ce sera possible, il faudra pondérer ou scorer ces données, pour par exemple préciser la fiabilité des données en question.

Le traitement des données pose aussi la question du choix du modèle statistique à utiliser. Le modèle le plus simple est le système de vote : il suffit de choisir le nombre de fois qu’une interaction doit être vérifiée pour être retenue; ce nombre varie de 1 à n, n étant le nombre de types de données utilisés (interactome, transcriptome...).

Des modèles statistiques plus sophistiqués peuvent être utilisés comme les arbres de décisions, les réseaux bayesiens ou la régression linéaire, mais pour cela il faut disposer de « training » sets.

Mais, il s’avère finalement que le choix du modèle statistique n’a que peu d’incidence sur les résultats obtenus. Le goulot d’étranglement reste l’étape de collection de données, notamment sa qualité et sa quantité.

IV Application pratique

Dans un article publié dans Nature (cf ref. 2), Gunsalus et ses collaborateurs nous font la démonstration de l’efficacité et de la puissance de la biologie intégrative dans l’étude des machines moléculaires impliquées dans l’embryogénèse précoce de C. elegans.

Leur expérience a lieu en 2 étapes :

- La 1^ère étape consiste à intégrer toutes les données possibles concernant le modèle choisi, soit : des données sur le profil phénotypique, l’interactome, et des données concernant le profil d’expression.
Et à partir de ces données, ils ont généré un réseau d’interactions fonctionnelles durant l’embryogénèse précoce chez C. Elegans

- La seconde étape consiste à utiliser le réseau d’interactions généré pour prédire le rôle et l’implication de certains gènes et protéines de C.elegans durant l’embryogénèse précoce.

a/ Intégration des données

Le but de cette étape est de bâtir des modèles de machines moléculaires impliquées dans l’embryogénèse précoce, et des connexions fonctionnelles entre ces machines. De tels modèles peuvent être déduits d’un réseau gène-protéine, lui-même généré par 3 types de de relations fonctionnelles : les interactions protéines-protéines (interactome), une carte des profils d’expression de gènes (transcriptome), et un profilage phénotypique des gènes.

L’intégration de l’ensemble de ces 3 types de données est réalisé en concevant un graphe dont chaque noeud correspond à un gène ou au produit de ce gène (ARN ou protéine), et chaque arête correspond à une relation fonctionnelle d’un des 3 types décrits ci. Les régions hautement interconnectée représentent chacune une machine moléculaire ou un processus biologique.

Modèle d’intégration des données dans le but de modéliser machines moléculaires (Source Gunsalus et al. (2005) )

1- Interactome utilisé

L’équipe de Gunsalus a utilisé un interactome (W17) généré à partir des résultats d’autres équipes, c’est-à-dire une combinant un interactome (W15) avec un set d’ « interologs » fly-to-worms, ces interologues sont des protéines de D.melanogaster qui interagissent entre elles et qui possèedent des homologues chez C.elegans. Il a ainsi obtenu un interactome de 3848 protéines liées par 6572 interactions.

Gunsalus a évalué la cohérence de l’interactome obtenu en comparant les interactions entre les protéines synthétisées lors de l’embryogénèse précoce, et celles de protéines prises au hasard dans le protéome de C.elegans. Sans surprise, les protéines exprimées lors de l’embryogenèse montre une plus grande connectivité.

Le sous-réseau représente les protéines exprimées lors de l’embryogenèse. Celui de gauche représente des protéines prises au hasard. Le sous-réseau de gauche montre une plus grande connectivité.

2- Transcriptome utilisé

Pour le transcriptome, Gunsalus utilise aussi les résultats d’une autre équipe obtenus par des expériences de puces à ADN, mais il applique à ces résultats un certain seuil par la méthode PCC (Pearson correlation coefficient).

PCC mesure le degré d’association entre « variables »

3- Profilage phénotypique

Le clustering par similarité phénotypique a été obtenu en appliquant un seuil sur le coefficient de corrélation (PCC) calculé sur les résultats d’expérience ARN interférent sur les 661 gènes identifiés de l’embryogénèse précoce.

Gunsalus a identifié 23 phénoclusters.

Clustering par similarité phnénotypique des 661 gèenes de l’embrypogenèes précoce chez C.elegans. (Source Gunsalus et al. (2005))

Gunsalus constate une forte corrélation entre le niveau de similarité phénotypique entre 2 gènes et le fait qu’ils partagent des attributs fonctionnels similaires (GO).

Cela confirme l’intérêt de la méthode.

b/ Fusion des 3 profils d’interaction

Afin d’évaluer la pertinence de fusionner les résultats obtenus par les 3 types de données (interactome, transcriptome, données phénotypiques), Gunsalus a mesuré le niveau de corrélation entre les résultats obtenus. Il a pu observé un haut niveau de corrélation.

Corrélations entre les différents set de données (Source Gunsalus et al. (2005) )

Gunsalus a donc pu procédé à la fusion des données obtenues, et il a ainsi créé un réseau (graphe) de 661 gènes/protéines (sommets) et 31173 interactions (arêtes).

Réseau d’intégration de tous les sets de données. Le diagramme de venn (en haut à gauche) correspond aux couleurs des arêtes en fonction des sets de données qui supportent les interactions représentées par l’arête. (Source Gunsalus et al. (2005) )

Mais Gunsalus est allé plus loin, puisque il a pris en compte le type d’interaction qui lie chaque paire de gènes/protéines : « Int » pour les interactions protéines/protéines, « Tr » pour les similarités d’expression, et « Ph » pour les similarité phénotypique, pour ensuite, à partir du graphe décrit ci-dessus, retenir un-sous-graphe ne contenant plus que les arêtes correspondant à au moins 2 des 3 types d’interactions Int, Tr et Ph. Il a ainsi obtenu ce qu’il appelle « le réseau à multiple support », qui ne contient plus que 305 des 661 noeuds initiaux(gènes/protéines); ce nouveau graphe révèle des groupes distinct de noeuds fortement interconnectés, et avec peu d’interactions entre les groupes.

Gunsalus a identifié 2 types de groupes :

- les groupes dont les noeuds sont interconnectés par des liens Int et Ph (ou par les 3 types). Ces groupes correspondent à des complexes moléculaires connus. Et grâce aux annotations fonctionnels (GO), Gunsalus a pu identifier chacune de ces machineries, dont entre autres : ribosome, proteasome, APC (anaphase-promoting complex) .

- les groupes dont les arêtes portent une corrélation Ph et Tr. Ces groupes correspondent à des gènes impliqués dans des processus cellulaires fonctionnels interdépendants : comme par exemple, le métabolisme ARNm/protéine (transcription, contrôle de la traduction, modification et trafic des protéines)

Ainsi, pour chacun des groupes, en se basant sur les annotations fonctionnelles, Gunsalus va associer soit une machinerie moléculaire, soit un ensemble de processus cellulaires interdépendants.

Multiple support Network ou réseau à support multiple (Source Gunsalus et al. (2005) )

c/ Prédiction de la fonction de gènes

À partir du « réseau à support multiple », Gunsalus a sélectionné 10 gènes dont la fonction est inconnue, mais associés à un des groupes de gènes du réseau, donc à une machinerie moléculaire; le but étant bien-sûr de vérifier si les gènes en question sont bien impliqués dans la machinerie moléculaire à laquelle le graphe les associe.

Pour cela, Gunsalus a utilisé une méthode différente de toutes celles utilisées pour générer l’ensemble des données : utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP, cf Références) suivie par l’observation in vivo par microscope à fluorescence. La localisation au sein de la cellule et en fonction du temps de la protéine issue du gène d’intérêt pourra confirmer ou infirmer la participation du gène/protéine à la machine moléculaire prédite.

Par exemple, l’un des 10 gènes sélectionnés est supposément impliqué dans la fonction centrosomale, et son observation par microscopie à fluorescence a démontré une présence dans 2 zones périnucléaires distinctes (présence compatible avec celles de centromères), et un comportement dynamique (déplacement) tout à fait conforme à celui des centrioles. La prédiction a donc été confirmée par l’expérience d’observation in vivo.

Pour 8 des 10 gènes sélectionnés, la prédiction a été vérifiée de façon évidente; pour les 2 autres, la prédiction n’a pu être infirmée ni confirmée.

Il est inutile d’appliquer un traitement statistique à ces résultats pour montrer qu’ils n’ont pas été obtenus par hasard. Gunsalus a démontré que l’étude du profilage phénotypique combiné à l’interactome et au transcriptome.

Il a prouvé ainsi que la biologie intégrative computationnelle est un outil puissant de prédiction fonctionnelle, et cet outil peut être utilisé dans un cadre bien plus large que l’embryogénèse précoce chez C. elegans.

Pattern de localisation embryonique de protéines fusionnées à GFP qui confirme le modèle de prédiction (Source Gunsalus et al. (2005) )

V Application dans le monde de l’industrie

Les cibles thérapeutiques sont les molécules de l’organisme sur lesquelles les médicaments développés par l’industrie agissent. La recherche de cible a lieu en 3 étapes :

- la découverte, que l’on peut apparenter à la création du réseau à support multiple présenté dans le chapitre précédent

- la sélection, que l’on peut comparer à la sélection des 10 gènes inconnus par Gunsalus

- la validation, que l’on peut comparer à la validation opérée par Gunsalus par l’expérience de microscopie à fluorescence

Le monde de la découverte et de la validation de cibles thérapeutiques est émergent et très prometteur, car en agissant très en amont dans la chaîne de développement des médicaments, on peut diminuer considérablement le coût de développement de médicaments.

En général, le taux de validation des cibles sélectionnées est de 5 à 10%. Mais, une entreprise comme Helios (France, cf Références), spécialisée dans la sélection de cibles thérapeutiques à partir d’outils de la biologie intégrative computationnelle, est de 70%!

Pour obtenir ce résultat, Helios a construit un outil de saisie et de construction de graphes d’interactions moléculaires. Ils ont aussi développé et valider des algorithmes permettant de modéliser le fonctionnement des réseaux d’interactions moléculaires avec notamment des réseaux complexes des 130 molécules.

L’utilité de la biologie intégrative computationnelle dans l’identification de potentielles cibles thérapeutiques a donc été prouvée.

Références

Référence principale

Zhong, w. And Sterneberg P.W. (2007) Automated data integration for developmental biological research. Development 134, 3227-3238

Exemple d’application de la biologie intégrative

Kristin C Gunsalus et al. (2005) Predictive models of molecular machines involved in Caenorhabditis elegans early embryogenesis. Nature 436, 861-865

Matériel supplémentaire de l’article Gunsalus et al.

http://www.nature.com/nature/journal/v436/n7052/suppinfo/nature03876.html

Définition de biologie intégrative

http://www.rhone-alpes-genopole.com/index.php?pageID=104&tabNum=3

Interactome utilisé par Gunsalus

Li, S. et al. (2004) A map of the interactome network of the metazoan C. elegans.

Science 303, 540-3

Matthews, L. R. et al. (2001) Identification of potential interaction networks using

sequence-based searches for conserved protein-protein interactions or "interologs".

Genome Res 11, 2120-6.

Présentation du projet GO (Gene Ontology)

http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_Ontology

http://artist.inist.fr/article.php3?id_article=261

GFP

http://fr.wikipedia.org/wiki/GFP

Technique Double-Hybride

http://en.wikipedia.org/wiki/Two-hybrid

Helios-bioscience

http://www.helios-bioscience.com/