Introduction

Contrairement à la génomique qui est basée sur l’isolement et la culture d’un génome donné, la métagénomique est une discipline émergente qui consiste à étudier l’ensemble des génomes présents dans un milieu par séquençage à haut débit et analyse de l’ensemble de l’ADN de ce milieu. Le terme métagénomique a été proposé pour la première fois par Handelsman et al en 1998 (1) mais son application n’a émergé que lors des dernières années avec la généralisation des techniques de séquençage haut débit.

En effet, les récents progrès en termes de technologies de séquençage haut débit, le développement de nouvelles méthodes bio-informatiques ainsi que le BIG-data ont permis des avancées importantes dans la métagénomique. Ainsi, son champ d’application a été élargi (santé, agro-alimentaire, écologie, foresterie, etc) et des projets de recherches d’envergure ont été menés à échelle internationale (2).

Toutefois, des défis techniques et conceptuels sont à relever. Ces défis sont liés principalement à l’analyse, l’exploitation et la qualité des données métagénomiques, car le séquençage d’un génome n’est pas applicable à tous les organismes. De plus, les séquenceurs « Next Generation Sequencing » (NGS) ont besoin d’une quantité importante de matériel génétique pour pouvoir produire des ensembles des données qui couvrent le génome dans son ensemble (3).

La métagénomique s’intéresse principalement à l’étude des microbiomes, mais peut aussi s’appliquer à l’étude de populations où il y a présence d’eucaryotes (ex : zooplancton dans un lac). Pour les eucaryotes il n’y a pas de problème au séquençage, car ces organismes multicellulaires peuvent produire de grandes quantités d’ADN. Cependant, pour les procaryotes cela peut poser problème puisque ce sont des organismes unicellulaires possédant de petits génomes. Il faut donc soit faire des cultures pour dupliquer ces cellules, sachant que la majorité de ces organismes ne peuvent survivre en milieux contrôlé, ou utiliser la technique « Single Cell Sequencing » (sc-seq). Cependant, l’inconvénient de cette dernière est qu’il peut y avoir certaines régions du génome qui sont favorisés : seulement 40% du génome est couvert en moyenne à la suite de l’amplification par PCR des gènes (3).

Types d’analyse des données métagénomiques

L’analyse de données métagénomiques cible donc une communauté et cherche à caractériser cette communauté afin de pouvoir faire des analyses différentielles entre plusieurs conditions, par exemple, ou seulement d’en apprendre plus sur une communauté. Il existe ainsi quatre types d’analyse des données métagénomiques possibles (3, 4) :

1- L’analyse taxonomique : un inventaire des taxons ou espèces présentes dans le milieu et leurs abondances.

2- Assemblage des différents génomes : assemblage partiel ou global des génomes d’espèces présentes dans le milieu selon la technique de séquençage utilisée.

3- L’analyse fonctionnelle : permet de déterminer la fonction d’une communauté dans son ensemble ou de diviser cette communauté en sous-groupes fonctionnels interagissant ensembles. Peut mener à la cartographie des voies métaboliques présentes dans une communauté.

L’analyse comparative : comparaison des données de plusieurs communautés provenant de différents milieux du même type (ex : microbiome racinaire d’une espèce d’arbre présente dans différents sols) ou conditions d’un même milieu (ex : microbiome buccal avec et sans maladie).

Stratégies en métagénomique

Il est important de pouvoir compter sur des techniques de séquençage ne se basant pas sur l’amplification des séquences présentes et ne requérant pas de culture puisque la majorité des microorganismes ne peuvent croitre en milieu artificiel. C’est pourquoi les technologies tels le « Whole Genome Shotgun » (WGS) et le séquençage ciblé sont si intéressants (2).

La métagénomique ciblée

Cette approche consiste à l’amplification puis au séquençage d’une région ou portion particulière du génome relativement petite en quelque centaines de paires de bases. Cette région est appelée marqueurs conservés, généralement on utilise les RNAs ribosomaux comme marqueurs. Pour les bactéries, il s’agit de l’ADN ribosomal 16S, qui est un excellent marqueur phylogénétique et un taux de mutation relativement stable puisque sa fonction est essentielle à l’organisme (2, 3).

Plusieurs autres marqueurs sont possibles dépendamment de l’ordre taxonomique observé. Ainsi pour les bactéries, on peut aussi utiliser ITS, CPN60 et RescA par exemple. Pour les eucaryotes, on utilise principalement l’ARN 18S qui est l’équivalent de l’ARN 16 des procaryotes et ITS. Pour les virus, on peut entre-autres utiliser Gp23(bacteriophagesT4-like), RdRp (picornaviruses) (3).

Figure 1 Stratégie ciblé : Seuls les ADNs du gène cible sont séquencés. Exemple en bactériologie, le gène cible est l'ARN 16S (5)

À la suite d’un séquençage, les « reads » appelés « Operational Taxonomic Units » (OTU) sont regroupés par similarité. Ainsi, on peut produire un graphique des groupes (« clusters ») afin de les identifier à un taxon ou une fonction. Ces groupes peuvent être comparés ou non à une référence selon trois stratégies : de novo où on ne compare pas à une référence; closed-reference où on se base uniquement sur la comparaison à des séquences connues; open-reference où on alie les deux autres stratégies. Plusieurs techniques de « clustering » sont possibles pour avoir des groupes plus ou moins rapprochés du centroïde (3, 6).

Selon Guyomar et al, (7) , les deux approches de métagénomique WGS et ciblée peuvent être utilisées conjointement. Elles sont complémentaires, notamment dans le cas des communautés les plus complexes, où les organismes rares ne peuvent être identifiés que par des méthodes ciblées

La métagénomique globale WGS

Comme son nom l’indique, cette stratégie permet d’étudier la composition globale du microbiome de l’échantillon environnemental. De plus, cette technique est effectuée sans faire d’amplification préalable des génomes. L'ensemble des ADNs du microbiote sont séquencés générant ainsi une importante quantité de fragments géniques de tous les organismes présents. Un assemblage des séquences obtenues en les comparant par alignement sur des génomes référencés permettent d’identifier les espèces connues formant le microbiome. Les génomes inconnus assemblés de novo puis annotés et incorporés dans des bases de données (3, 4).

Figure 2 Stratégie globale : L'ensemble des ADNs présents dans un échantillon de microbiote sont séquencés (5).

Il existe deux approches à la stratégie WGS, la première est basée sur les « reads » et cherche à classifier les « reads » dans un optique de taxonomie et de fonction. L’alignement est donc fait avec des génomes de références dès le début et peut être pratique pour la détection d’organismes d’intérêt. La deuxième stratégie est basée sur l’assemblage, on y assemble tous les fragments de novo en groupements génomiques puis ils sont comparés à des génomes connus (« binning »). Cette deuxième stratégie permet la découverte de nouveaux génomes plus facilement (4, 6).

Outils principaux en métagénomique

La métagénomique est une approche de plus en plus populaire dans plusieurs domaines dont l’écologie, la biologie médicale, la criminalistique, etc. Il existe donc de nombreux outils pour analyser et visualiser les résultats de séquençage. De plus, puisque c’est une avenue de plus en plus populaire grâce à l’accessibilité des NGS qui augmente, il y a souvent de nouveaux outils qui sont développés. Ainsi on essaiera de présenter une liste exhaustive des outils principaux pour les deux approches de la métagénomique. Certains outils sont disponibles sur le web et possibilité d’installation locale tandis que d’autres sont uniquement disponibles pour installation locale ou sur des serveurs de calcul.

Outils spécialisés en métagénomique ciblée

Qiime2 : Outils en ligne de commande permettant l’analyse de données brutes de séquençage. Il permet aussi l’identification des OTU et la reconstruction phylogénétique. De plus, il permet de produire des graphiques facilement et de bonne qualité. (3, 8-10)

UPARSE : Outils en ligne de commande permettant l’identification de clusters à partir de données de séquençage d’ARN 16S.(8, 11)

Mothur : Outils en ligne de commande visant à exprimer les variations environnementales. Permet le clustering via l’identification d’OTU. (3, 8, 12)

DADA2 : Package R permettant l’identification des OTU, la filtration, l’identification de chimères et autres à partir de résultats d’amplicons ciblés.(8, 13)

MED : Package R permettant l’utilisation de gènes cibles. Permet aussi d’intégrer les résultats métagénomiques dans un optique écologique et de phylogénétique. (8, 14)

METAVIR2 : Outils web permettant l’analyse de séquençage métagénomique uniquement pour les virus. Fourni des arbres phylogénétiques pré-faits à partir de gènes cibles. (15, 16)

Outils spécialisés en métagénomique globale WGS

MataPhlAn2 : Outils en ligne de commande permettant l’analyse du profil bactérien. Produit des graphiques de grande qualité. (3, 8, 9, 17)

Kraken : Outils en ligne de commande permettant l’identification taxonomique de séquences d’ADN en utilisant l’alignement de k-mers. Il est disponible en deux versions Kraken et mini-Kraken. Le second est plus rapide, mais prend moins de paramètres en compte. (8, 18)

CLARK : Outils en ligne de commande permettant la classification de séquences nucléiques en se basant sur une classification supervisée et en utilisant un jeu réduit de k-mers. (8, 19)

MOCAT : Outils en ligne de commande proposant un « pipeline » rapide et personnalisable. Permet la prédiction de gènes codant pour des protéines. Compare les séquences à des bases de données et retourne les résultats sous forme de fichier Excel et base de données SQL. (9, 20)

VIROME : Outils web permettant l’analyse de données métagénomiques virales. La classification est faite à l’aide des ORF en se basant sur les données connues par le serveur de données et les séquences environnementales. Fourni une interface graphique pour l’exploration et l’interprétation facilitée des résultats. (16, 21)

Outils pouvant effectuer les deux types d’analyses

MG-RAST : Outils web se basant sur d’autres serveurs et outils permettant le profilage fonctionnel et la composition de communautés microbiennes. Permet de générer des graphiques élaborés selon le besoin. Prend en charge les données métagénomiques brutes et les analyse avec son propre « workflow » automatiquement en plus de faire l’annotation des séquences. (8, 16, 22)

METAGENassist : Outils web gratuit permettant l’analyse statistique multivariée des données générées par d’autres outils d’analyse de métagénome. Peut produire un consensus entre des microbiomes multiples ainsi qu’une cartographie phénotypique des microbiomes. (16, 23)

EBI Metagenomics : Interface web développé par l’EBI. Il utilise des outils de Qiime et autres développés par l’EBI pour l’analyse des métagénomes. La base de données utilisé est celle de l’EMBL-EBI pour comparaison de toutes les séquences et permet l’intégration dans la base de données directement. L’outils permet aussi de faire de contrôle de qualité et le « trimming » des séquences. (16, 24)

Limites de la métagénomique

Selon Siegwald (25), la métagénomique a plusieurs limites :

· Approche descriptive : la métagénomique permet de décrire et identifier les espèces présentes dans le microbiote étudié. La compréhension du fonctionnement de la variation des microbiotes reste un enjeu à appréhender et l’intégration des métadonnées relative à l’écosystème devrait permettre d’orienter la métagénomique vers une direction explicative et prédictive. (25, 26)

· Absence d’une méthode standard de référence et analyse des données générées : Tel que vu dans les outils, il existe de nombreux « workflow » pour l’analyse des données métagénomiques ce qui les rend difficile à comparer entre elles. De plus, il n’existe aucun consensus sur l'approche analytique à mener dans un contexte métagénomique malgré l’abondance de l’offre des logiciels d’analyses. Cela est dut au fait qu’il n’existe pas une méthode ou un processus de référence à suivre pour mener un projet métagénomique. (25, 27)

· La sélection d'un locus cible suffisamment discriminant entre les organismes d'intérêt, fortement limitée par la courte taille des lectures de séquençage (< 500 nt). Au vu de cette quantité d’information restreinte, la métagénomique ne permet ainsi pas d'obtenir une image détaillée du microbiote d'intérêt, l’information contenue dans la littérature n’étant pas souvent suffisante pour discriminer les espèces entre elles. Le profilage phylogénétique pourrait être amélioré par l'utilisation des 40 gènes essentiels au lieu de se focaliser seulement sur le 16S puisque cela entraine une diminution de la résolution des résultats. (25, 26)

Références

1. Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, Clardy J, Goodman RM. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chem Biol. 1998;5(10):R245-R9.

2. Sudarikov K, Tyakht A, Alexeev D. Methods for The Metagenomic Data Visualization and Analysis. Current Issues in Molecular Biology. 2017:37-58.

3. Aouabed Z. Métagénomique et la bioinformatique des séquences. UQAM; 2020.

4. Jünemann S, Kleinbölting N, Jaenicke S, Henke C, Hassa J, Nelkner J, et al. Bioinformatics for NGS-based metagenomics and the application to biogas research. Journal of Biotechnology. 2017;261:10-23.

5. Schutz S. Introduction à la métagénomique Date inconnue [Available from: http://dridk.me/metagenomique.html.

6. Ghurye JS, Cepeda-Espinoza V, Pop M. Metagenomic Assembly: Overview, Challenges and Applications. Yale J Biol Med. 2016;89(3):353-62.

7. Guyomar C, Delage W, Legeai F, Mougel C, C., Simon J-C, Lemaitre C. Reference guided genome assembly in metagenomic samples. RECOMB 2018 - 22nd International Conference on Research in Computational Molecular Biology; 2018-04-21; Paris, France2018. p. 1.

8. Niu S-Y, Yang J, McDermaid A, Zhao J, Kang Y, Ma Q. Bioinformatics tools for quantitative and functional metagenome and metatranscriptome data analysis in microbes. Briefings in Bioinformatics. 2017;19(6):1415-29.

9. Escobar-Zepeda A, Godoy-Lozano EE, Raggi L, Segovia L, Merino E, Gutiérrez-Rios RM, et al. Analysis of sequencing strategies and tools for taxonomic annotation: Defining standards for progressive metagenomics. Sci Rep. 2018;8(1):12034-.

10. Kuczynski J, Stombaugh J, Walters WA, González A, Caporaso JG, Knight R. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Curr Protoc Bioinformatics. 2011;Chapter 10:Unit10.7-.7.

11. Edgar RC. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods. 2013;10(10):996-8.

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25. Siegwald La. Solutions to improve targeted metagenomics studies: Université du Droit et de la Santé - Lille II; 2017.

26. Rogue M. La métagénomique et les défis pour la bioinformatique au goût #IHMC2012 2012 [updated 2012/04/04. Available from: https://bioinfo-fr.net/la-metagenomique-et-les-defis-pour-la-bioinformatique-au-gout-ihmc2012.

27. Champomier-Verges M-C, Zagorec M. La métagénomique : développements et futures applications: Editions Quae; 2015 2015. 116 p.